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豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的操作方法

更新日期: 2023-09-19
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病毒DNA的提取:
1.取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動(dòng),不要吸到上層保護(hù)液),用力顛倒10次混勻,12,000rpm離心10min。
2.取500µL上清置于滅菌離心管中,加入500µL異丙醇,混勻,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管,室溫融化,13,000rpm離心15min。
3.棄上清,沿管壁緩緩加入1mL洗滌液,輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉,將離心管倒扣于吸水紙上1min,再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
4.用30µL無菌水溶解沉淀,作為模板備用。
樣品制備:
1.樣品采集:病死或撲殺的豬,取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結(jié)等組織;待檢活豬,用棉拭子取鼻腔分泌物,置于50%甘油生理鹽水中,或用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2.樣品處理:
2.1組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物;然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心5min,取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
2.2全血樣品的處理:待血凝后取血清放于離心管中,8000rpm離心5min,取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
2.3陽性對照的處理:混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
2.4陰性對照的處理:混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中,加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
PCR:
1.反應(yīng)體系:分別取16µLPCR反應(yīng)液A(用前混勻)、2µLPCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板DNA,混勻。
2.反應(yīng)程序:在PCR儀上運(yùn)行以下程序:94℃3min;94℃30s、55℃30s、72℃30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。
電泳:
1.制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳:待膠凝固后,取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色:取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結(jié)果。
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