實時熒光PCR技術是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。實時熒光PCR試劑盒作為這一技術的載體，在醫(yī)學診斷、基因表達研究和遺傳疾病篩查等領域發(fā)揮著重要作用。
一、工作原理
實時熒光PCR試劑盒的工作原理基于DNA聚合酶在PCR過程中合成新DNA鏈的特性，結合熒光標記的探針或染料，通過實時監(jiān)測熒光信號的增加來測量PCR反應的進行程度。具體而言，工作過程包括以下幾個關鍵步驟：
1、DNA模板的擴增：PCR反應中的DNA模板在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)過一系列的溫度循環(huán)(變性、退火、延伸)進行擴增。每個循環(huán)中，DNA雙鏈在高溫下變性成單鏈，然后引物與單鏈DNA結合，并在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。
2、熒光信號的實時監(jiān)測：在PCR反應體系中加入熒光標記的探針或染料。這些熒光物質在PCR反應過程中，隨著DNA拷貝數(shù)的增加，與DNA產(chǎn)物結合并發(fā)出熒光信號。實時熒光PCR儀器通過檢測這些熒光信號的變化，實時監(jiān)測PCR反應的進程。
3、熒光信號的定量分析：通過實時熒光PCR儀器收集到的熒光數(shù)據(jù)，可以繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。在PCR反應早期，熒光信號較弱，隨著反應的進行，熒光信號逐漸增強，進入指數(shù)增長期。當反應達到一定的熒光強度閾值時，所需的循環(huán)數(shù)被稱為Ct值(Cyclethreshold)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。
4、定量計算：利用已知起始拷貝數(shù)的標準品制作標準曲線，標準曲線的橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。對于未知樣品，只要獲得其Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
實時熒光PCR試劑盒中的熒光物質可以分為兩類：熒光探針和熒光染料。熒光探針通常是一段與目標DNA序列互補的寡核苷酸，兩端分別標記有熒光基團和淬滅基團。當探針與目標DNA序列結合時，熒光基團和淬滅基團接近，熒光信號被淬滅。在PCR延伸過程中，DNA聚合酶將探針切割，熒光基團和淬滅基團分離，熒光信號增強。熒光染料則是一種能夠非特異性地結合到DNA雙鏈上的小分子，當DNA雙鏈增多時，染料結合量增加，熒光信號增強。
二、優(yōu)勢
實時熒光PCR試劑盒相比傳統(tǒng)PCR方法具有以下幾個顯著優(yōu)勢：
1、快速準確：實時熒光PCR能夠在較短時間內完成DNA的檢測和定量，通常只需幾個小時。同時，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，能夠提供可靠的擴增效率和準確的定量結果。
2、高靈敏度：能夠檢測極少量的目標DNA序列，甚至達到單拷貝水平的靈敏度。這使得實時熒光PCR成為檢測低濃度DNA樣本的理想選擇。
3、定量檢測：實時熒光PCR通過熒光信號的變化，可以對DNA產(chǎn)物進行實時定量檢測，無需后續(xù)分析。這一特性使得實時熒光PCR在病毒載量監(jiān)測、基因表達研究等領域具有廣泛應用。
4、多重檢測：通過使用不同的熒光標記和探針，可以同時檢測多個DNA序列。這一特性大大提高了檢測效率，減少了樣本量和試劑消耗。
5、自動化和高通量：實時熒光PCR試劑盒可以與實時熒光PCR儀器結合使用，實現(xiàn)自動化操作和高通量檢測。這使得實時熒光PCR成為處理大量樣本的理想選擇，特別適用于大規(guī)模篩查和診斷。
6、廣泛的應用領域：實時熒光PCR試劑盒在醫(yī)學診斷、基因表達研究、遺傳疾病篩查、藥物療效考核、腫瘤基因檢測等領域具有廣泛應用。通過實時熒光PCR技術，我們能夠更好地了解DNA的特性，推動科學研究和醫(yī)學診斷的進步。
三、應用案例
1、醫(yī)學診斷：實時熒光PCR技術在醫(yī)學診斷中具有重要作用。例如，在結核菌基因診斷中，實時熒光PCR可以區(qū)分結核桿菌與其他分枝桿菌，檢測結核桿菌的耐藥基因，提高結核病的陽性檢出率。在產(chǎn)前診斷中，實時熒光PCR可以從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，進行無創(chuàng)傷性的性別鑒定和遺傳性疾病篩查。
2、基因表達研究：實時熒光PCR技術是研究基因表達的重要手段。通過實時熒光PCR技術，可以定量檢測特定基因的表達水平，研究基因表達與疾病之間的關系，為疾病的診斷和治療提供科學依據(jù)。
3、遺傳疾病篩查：實時熒光PCR技術在遺傳疾病篩查中發(fā)揮著重要作用。通過檢測特定基因的突變或缺失，可以預測個體患遺傳疾病的風險，為早期干預和治療提供依據(jù)。
4、藥物療效考核：實時熒光PCR技術在藥物療效考核中具有重要應用。例如，在乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的定量分析中，實時熒光PCR可以檢測病毒載量，評估藥物的療效和病毒變異情況。
5、腫瘤基因檢測：實時熒光PCR技術在腫瘤基因檢測中具有廣泛應用。通過檢測腫瘤相關基因的突變和表達水平，可以預測腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，為腫瘤的診斷和治療提供科學依據(jù)。
